高速離心機分離的幾種方法

　　制備型超高速離心機的幾種分離方法：
 

　　A.差速離心：逐次增加離心力，每次可沉降樣品溶液中的一些組份。
 

　　差速離心是一種常用的方法。在這種方法中，離心管在開始時裝滿了均一的樣品溶液。通過在一定速度下一定時間的離心后，就可得到兩個部份：沉淀和上清液。
 

　　通常在第1次離心時把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到的上清液以更高速度離心，把所需的粒子沉積下來。離心的時間要選擇得當，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對于得到的沉淀和上清液可以進行進一步的離心，直到達到所需要的分離純度為止。
 

　　差速離心的特點是操作簡單，但分離純度不高。
 

　　B.密度梯度離心法：可以同時使樣品中幾個或全部組份分離，具有很好的分辨率。
 

　　1)速率區帶法(ratezonal)：
 

　　根據樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步驟如下：
 

　　在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度)。
 

　　將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負梯度。
 

　　由于不同大小的粒子在離心力作用下，在梯度中移動的速度不一樣，所以經過離心后會形成幾條分開的樣品區帶。
 

　　注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點的密度。離心過程必須在區帶到達管子底部前停止。
 

　　2)等密度離心法(isopycnic)：
 

　　根據粒子的不同密度來分離。離心過程中，粒子會移至與它本身密度相同的地方形成區帶。
 

　　密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經離心后，樣品粒子達到它們的平衡點。注意：平衡后粒子的分離*由其密度決定，與時間無關，此時再改變離心轉速，只能改變區帶的相對位置。2.密度梯度分析法
 

　　1)梯度介質性質與選擇：
 

　　A、應具備的性質：
 

　　梯度物質的選擇原則是滿足分離方法的基本要求，一個理想的密度材料標準它應是：
 

　　·所形成的溶液密度應包括所需要的密度范圍。
 

　　·具有某些性質，如折射率，據此可測定它的濃度。
 

　　·所形成的溶液粘度低。
 

　　·不損傷所分離的樣品。
 

　　·離心分離后容易除去。
 

　　·不妨礙分離積分的分析。
 

　　B、常用介質種類：
 

　　表一、常用梯度材料在20℃密度
 

　　B.梯度介質應用范圍：
 

　　表二、等密度梯度介質的應用
 

　　+++很好++好+可以--不適用
 

　　表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度
 

　　(2)、梯度溶液的準備：
 

　　計算
 

　　稀釋(本文第三章第1部分)
 

　　(3)、梯度形狀
 

　　梯度形狀分：線型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數梯度。(如下圖)
 

　　梯度形狀對于分離是否成功非常重要：
 

　　常用的是線型梯度，適用于分離蛋白質、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒;等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品;不連續或階梯型梯度適用于分離整細胞、亞細胞組分以及純化一些哺乳類動物病毒或昆蟲病毒。等速梯度以及長液柱可增進分離能力，適用于分離核糖體亞基、多核糖體及植物病毒。
 

　　B.梯度柱制備：
 

　　梯度液柱可以用手工或梯度儀制備
 

　　半注法：
 

　　為縮減離心時間，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質，中間加樣品，上面鋪Buffer或液體石臘油。
 

　　(4)、加樣方法與加樣量：
 

　　將樣品加到梯度液柱上，針尖和離心管成45-60°角度，慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去，對于DNA一類易斷的脆弱樣品，應該用孔徑較大的移液管代替針頭，以避免剪切力對樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱小密度的1/10(W/W)。
 

　　(5)、轉子的選擇與效應：
 

　　(6)、分離區帶的回收及檢測
 

　　離心后所形成的區帶樣品的回收方法基本有四種：
 

　　a.穿刺法
 

　　穿刺離心管底部，使梯度溶液滴出，將一具有合適閥門的蓋帽放在離心管頂，可控制滴出速度。
 

　　b.虹吸法：
 

　　將一毛細管輕輕插入管底，盡量防止梯度抖動，用微量泵逐漸滴取，以一定量滴數或體積部分收取。
 

　　c.加壓法：
 

　　通過一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部，部分收集換出的溶液。
 

　　d.切割法：
 

　　采用的切割刀切割所需區帶。
 

　　圖片
 

　　區帶檢測：
 

　　所謂區帶檢測，實際上是對水平轉子或角轉子和垂直轉子離心管中的分離物質所做的監測，通常只是測量在260或280mm時長的吸收值，以決定梯度中的核酸或蛋白的整個分布，這個操作通常稱之為在線(online)監測。
 

　　如何正確維護你的離心機
 

　　離心機的發展離心機是將樣品進行分離的儀器，廣泛應用于生物醫學、石油化工、農業、食品衛生等領域。離心機自問世以來，歷經低速、調整、超速的變遷，其進展主要體現在離心設備和離心技術兩方面，二者相輔相成。從轉速看，臺式離心機基本屬于低速、高速離心機的范疇，通用臺式離心機的發展已經模糊了低速、高速、微量和大容量離心機的界線，眾多的轉頭為科研人員提供相當廣泛的應用范圍，成為科研實驗室機型。
 

　　離心機原理
 

　　利用離心力，根據混合物中各組分沉降系數、質量、密度等的不同原理，將樣品混合物中的液體與固體顆粒或液體與液體分離出來。
 

　　離心機分類
 

　　離心機是實驗室極常見的分離儀器按轉速可分為低速離心機、高速離心機、超速離心機等；
 

　　常速離心機：轉速小于3500r/min
 

　　高速離心機：轉速在3500r/min~50000r/min之間
 

　　超高速離心機：轉速大于50000r/min。
 

　　按溫度可分為冷凍離心機、常溫離心機；
 

　　按容量可分為微量離心機、大容量離心機、超大容量離心機；
 

　　按外型可分為臺式離心機、落地式離心機。
 

　　使用守則
 

　　使用離心機首重安全，離心力失控可能造成很大的破壞。因此要注意離心管是否平衡，轉速是否超過設置，轉子是否有腐蝕等。
 

　　離心機使用起來看似簡單，沒有技術含量，但是正確的使用及維護還是很有必要，一旦發生故障，對實驗造成延誤，也是得不償失。
 

　　一.離心機在預冷狀態時，離心機蓋必須關閉，離心結束后取出的轉頭要倒置于實驗臺上，擦干腔內余水，此時離心機蓋處于打開狀態。
 

　　二.轉頭在預冷時轉頭蓋可擺放在離心機的平臺上，或擺放在實驗臺上，千萬不可不擰緊浮放在轉頭上，因為一旦誤啟動，轉頭蓋就會飛出，造成事故！
 

　　三.轉頭蓋在擰緊后一定要用手指觸摸轉頭與轉蓋之間有無縫隙，如有縫隙要擰開重新擰緊，直至確認無縫隙方可啟動離心機。
 

　　四.在離心過程中，操作人員不得離開離心機室，一旦發生異常情況操作人員不能關電源(POWER)，要按STOP。在預冷前要填寫好離心機使用記錄。
 

　　五.不得使用偽劣的離心使管，不得用老化、變形、有裂紋的離心管。
 

　　六.在節假日和晚間后一個使用離心機須例行安全檢查后方能離去。
 

　　七.在儀器使用過程中發生機器故障，部件損壞情況時要及時與生產廠家聯系
 

　　使用注意
 

　　實驗室常用的是電動離心機電動離心機轉動速度快，要注意安全，特別要防止在離心機運轉期間，因不平衡或試管墊老化，而使離心機邊工作邊移動，以致從實驗臺上掉下來，或因蓋子未蓋，離心管因振動而破裂后，玻璃碎片旋轉飛出，造成事故。因此使用離心機時，必須注意以下操作。
 

　　(1)離心機套管底部要墊棉花或試管墊。
 

　　(2)電動離心機如有噪音或機身振動時，應立即切斷電源，即時排除故障。
 

　　(3)離心管必須對稱放入套管中，防止機身振動，若只有一支樣品管另外一支要用等質量的水代替。
 

　　(4)啟動離心機時，應蓋上離心機頂蓋后，方可慢慢啟動。
 

　　(5)分離結束后，先關閉離心機，在離心機停止轉動后，方可打開離心機蓋，取出樣品，不可用外力強制其停止運動。
 

　　(6)離心時間一般1～2分鐘，在此期間，實驗者不得離開去做別的事。
 

　　電動使用注意問題
 

　　在企業或院校研究機構中，轉速在3000轉左右的低速實驗離心機已經比較常用，如315型過濾+沉降一體式實驗離心機，100型實驗離心機，200型實驗離心機等。這些離心機設計合理，重心低，安全穩定，在化工、食品、醫療等領域的前期試樣分析中得到了更大的應用。
 

　　操作方法
 

　　1、使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內容物，平衡時重量之差不得超過各個離心機說明書上所規定的范圍，每個離心機不同的轉頭有各自的允許差值，轉頭中不能裝載單數的管子，當轉頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉頭中，以便使負載均勻地分布在轉頭的周圍。
 

　　2、若要在低于室溫的溫度下離心時。轉頭在使用前應放置在冰箱或置于離心機的轉頭室內預冷。
 

　　3、離心過程中不得隨意離開，應隨時觀察離心機上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應立即停機檢查，及時排除故障。
 

　　4、每個轉頭各有其高允許轉速和使用累積*，使用轉頭時要查閱說明書，不得過速使用。每一轉頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉頭的高使用*，則須按規定降速使用。
 

　　5、裝載溶液時，要根據各種離心機的具體操作說明進行，根據待離心液體的性質及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細檢查轉頭，及時清洗、擦干，轉頭是離心機中須重點保護的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉頭長時間不用時，要涂上一層上光臘保護，嚴禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。
 

　　日常保養
 

　　轉子
 

　　離心機運轉前應先切斷電源并先松開離心機剎車，可以手試轉動轉鼓，看有無咬煞情況。
 

　　檢查其他部位有無松動及不正常情況。
 

　　接通電源依順時針方向開車啟動(通常從靜止狀態到正常運轉約需40-60秒左右)。
 

　　通常每臺設備到廠后均須空車運轉3小時左右，無異常情況即可工作。
 

　　物料盡可能要放置均勻。
 

　　必須專人操作，容量不得超過額定量。
 

　　嚴禁機器超速運轉，以免影響機器使用壽命。
 

　　機器開動后，若有異常情況必須停車檢查，必要時需予以拆洗修理。
 

　　離心機工作時是高速運轉，因此切不可用身體觸及其轉鼓，以防意外。
 

　　濾布的目數應根據所分離物料的固相顆粒的大小而定，否則影響分離效果。另外濾布安裝時應將濾布
 

　　密封圈嵌入轉鼓密封槽內，以防物料跑入。
 

　　為確保離心機正常運轉，轉動部件請每隔6個月后加油保養一次。同時查看軸承處運轉潤滑情況，有無磨損現象；制動裝置中的部件是否有磨損情況，嚴重的予以更換；軸承蓋有無漏油情況。
 

　　機器使用完畢，應作好清潔工作，保持機器整潔。
 

　　不要將非防腐型離心機與于高腐蝕性物料的分離；另外嚴格按照設備要求、規定操作，非防爆型離心機切不可用于易燃、易爆場合。
 

　　“喘振”
 

　　制冷離心式機組的離心機常發生“喘振”現象。
 

　　制冷離心壓縮機原理是將大分子量的制冷劑通過高速運動將其積壓到小的空間進行壓縮，然后通過降溫進行冷凝。
 

　　離心式冷水機組能量調節方式是靠調節高速轉動的導片角度來調節壓縮比
 

　　當供冷量下降的時候，導片做的功降低，壓縮出去的氣體壓力和吸入壓縮機的氣體壓力相近，導致氣體回流產生機械的強迫震動。(也稱“喘振”)喘振會造成機械部件的損壞。